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Evolution der chloroplastidären und cytosolischen 6-Phosphogluconat-Dehydrogenasen höherer Pflanzen

Karsten Krepinsky

ISBN 978-3-89722-978-5
85 Seiten, Erscheinungsjahr: 2002
Preis: 40.50 €
Die chloroplastidäre 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (cp6PGDH) aus Spinatblättern wurde tausendfach bis zur Homogenität mit Hilfe der folgenden Schritte gereinigt: Polyethylenimin-Fällung, Anionenaustauschchromatographie an Diethylaminoethyl-Fractogel, Gelfiltration in Superdex G200 und Affinitätschromatographie an ADP-Agarose. Das Enzym hatte eine spezifische Aktivität von 60 U/mg und einen isoelektrischen Punkt von 4,9. Es ist ein Homodimer mit Untereinheiten von 50 kDa. Für 6-Phosphogluconat wurde eine Michaelis-Konstante von 40 ÁM und für NADP+ eine Michaelis-Konstante von 6 ÁM bestimmt. Gegen das gereinigte Enzym hergestellte polyklonale Antikörper erkannten ein Protein von 53 kDa in einem Rohextrakt und zeigten proteolytische Veränderungen während der Reinigung auf.

Die Mikrosequenzierung der gereinigten cp6PGDH war aufgrund der N-terminalen Blockierung des Proteins nicht möglich. Nach der Spaltung des Proteins mit der Endoproteinase LysC wurden vier der resultierenden Peptide sequenziert. Mit Hilfe von degenerierten Primern gegen die sequenzierten Peptide wurden durch PCR zunächst genspezifische Fragmente aus einer cDNA-Bank amplifiziert. Anschließend wurde mit Hilfe von genspezifischen Primern die vollständige cDNA für die cp6PGDH aus Spinatblättern kloniert. Auf die gleiche Weise konnte zusätzlich die cDNA für die cytosolische 6PGDH aus Spinatblättern mit Hilfe von degenerierten Primern gegen konservierte Bereiche bekannter cytosolischer 6PGDHn kloniert werden.

Die phylogenetische Analyse zusammen mit vorhandenen eukaryotischen und prokaryotischen 6PGDHn ergab, dass die pflanzlichen Sequenzen die höchste Ähnlichkeit mit ihren cyanobakteriellen Homologen besitzen, während die Sequenzen aus Tieren und Pilzen die höchste Ähnlichkeit mit denen aus beta- und gamma-Proteobakterien aufweisen. Die 6PGDHn höherer Pflanzen wurden folglich von den cyanobakteriellen Vorläufern der Plastiden durch Endosymbiose und anschließenden Gentransfer zum Nukleus erworben. In der Folge entstanden im Laufe der pflanzlichen Evolution aus einer Duplikation des cyanobakteriellen Gens die heute vorliegenden chloroplastidären und cytosolischen 6PGDHn höherer Pflanzen. Die cytosolischen 6PGDHn cyanobakteriellen Ursprungs traten an die Stelle der bereits existierenden cytosolischen Homologe proteobakteriellen Ursprungs, welche noch immer in Tieren und Pilzen vorzufinden sind. Aus der Affinität der 6PGDH und der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Trypanosoma brucei zu den cyanobakteriellen bzw. pflanzlichen Sequenzen in phylogenetischen Analysen wurde gefolgert, dass dieser Humanparasit einst einen Plastiden besaß und sekundär nicht-phototroph ist.

Mit Hilfe einer phylogenetischen Analyse konnte weiterhin gezeigt werden, dass höhere Pflanzen zwei chloroplastidär lokalisierte Transaldolasen eubakteriellen Ursprungs besitzen. Die 6-Phosphogluconolactonasen höherer Pflanzen hatten in einer phylogenetischen Analyse die höchste Ähnlichkeit mit ihren Homologen aus Tieren und Pilzen und waren ebenfalls eubakteriellen Ursprungs. Die Enzyme des OPPW von höheren Pflanzen sind somit ausnahmslos eubakteriellen Ursprungs und wurden durch endosymbiontischen Gentransfer entweder von den cyanobakteriellen Vorgängern der Plastiden oder einer anderen eubakteriellen Quelle - wahrscheinlich von den alpha-proteobakteriellen Vorgängern der Mitochondrien - erworben.

Chloroplast 6-phosphogluconate dehydrogenase (cp6PGDH) from spinach leaves was purified 1000-fold to apparent homogeneity from a crude extract by the following steps: polyethyleneimine precipitation, anion-exchange chromatography on DEAE-Fractogel, gel filtration in Superdex G200, and by affinity chromatography on ADP-Agarose. The final specific activity of the enzyme preparation was 60 U/mg. The enzyme is a homodimer with subunits of 50 kDa. The enzyme showed classical Michaelis-Menten kinetics with both substrate and cofactor. The Km (6-phosphogluconate) was 40 ÁM and the Km (NADP) was 6 ÁM. Antibodies raised against the purified cp6PGDH detected a 53 kDa protein from a crude extract, indicating alterations during purification.

Attempts to sequence the undigested protein failed, probably due to a blocked N-terminus. When the enzyme was digested with endoproteinase LysC, the sequences of four of the resulting peptides were obtained. These peptides were used to design degenerate primers and to isolate gene-specific fragments by PCR from a cDNA library of spinach. The complete cDNA of cp6PGDH was determined by PCR with gene-specific primers and subsequent cloning and sequencing of the amplification products. The cytosolic 6PGDH from spinach leaves was also cloned with the same method as used for the cp6PGDH except with degenerate primers against conserved regions of known plant cytosolic sequences.

Phylogenetic analysis in the context of available homologues from eukaryotes and prokaryotes revealed that animal and fungal cytosolic 6PGDH sequences are more similar to their homologues from beta- and gamma-proteobacteria, whereas plant 6PGDH is more similar to its cyanobacterial homologues. The ancestral gene for higher plant 6PGDH was acquired from the antecedent of plastids through endosymbiosis and gene transfer to the nucleus. A subsequent gene duplication gave rise to higher plant cytosolic 6PGDH, which assumed the function of its pre-existing cytosolic homologue through endosymbiotic gene replacement. The protein phylogeny of both 6PGDH and of the first enzyme of the oxidative pentose phosphate pathway, glucose-6-phosphate dehydrogenase, indicated a surprisingly close relationship between the plant and Trypanosoma brucei lineages, suggesting that this human parasite may be secondarily non-photosynthetic.

The protein phylogeny of transaldolase indicated the existence of two distinct chloroplast enzymes in higher plants, which are of eubacterial origin. 6-phosphogluconolactonases of higher plants were most similar to their homologues from animals and fungi and of eubacterial origin. The enzymes of the oxidative pentose phosphate pathway of higher plants are without exception of eubacterial origin and were acquired through endosymbiotic gene transfer from the cyanobacterial ancestor of plastids or another eubacterial source - most likely the alpha-proteobacterial ancestor of mitochondria.

Keywords:
  • Oxidativer Pentosephosphat-Weg
  • Endosymbiontischer Gentransfer
  • Chloroplasten
  • Mitochondrien
  • Lateraler Gentransfer

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