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Assoziation zwischen dem Verlust des Tuberöse-Sklerose-Gen-2-Produktes Tuberin und Agiogenese

Phuong-Anh Vu

ISBN 978-3-89722-839-9
127 Seiten, Erscheinungsjahr: 2002
Preis: 40.50 €
Das Wachstum von Tumoren in mehrzelligen Organismen ist von der Entwicklung der Angiogenese abhängig. Störungen in der Zellregulierung können zur Expression von angiogenetischen Wachstumsfaktoren und folglich zur Tumorgenese führen. In den letzten Jahren konnte bei vielen Tumorerkrankungen gezeigt werden, dass der Verlust von Tumorsuppressorgenen zur Angiogenese beiträgt. Bei der Tuberösen Sklerose (TS), einer autosomal dominant-vererbten Erkrankung, ist die Ursache der Tumorbildung in den verschiedenen Organen die Mutation von zwei Tumorsuppressorgenen, dem TSC1-Gen oder dem TSC2-Gen. Die kodierten Proteine heißen Hamartin (für TSC1) und Tuberin (für TSC2). In der vorliegenden Arbeit wird eine Assoziation zwischen dem Verlust des TSC2-Gens und der Angiogenese beschrieben. Angiofibrome sind eine Manifestation der TS. Sie bestehen aus vaskulären und interstitiell bindegewebigen Elementen der Haut. In Voruntersuchungen konnte der Verlust von Tuberin im interstitiellen Teil der Angiofibrome gezeigt werden. Immunhistochemische Analysen von Angiofibromen wurden mit Hilfe von Antikörpern gegen angiogenetische Wachstumsfaktoren durchgeführt. In allen 10 untersuchten Angiofibromen wurden die Wachstumsfaktoren VEGF, Angiogenin, bFGF, PD-ECGF und PDGF-B in den interstitiellen und vaskulären Zellen detektiert. Die Expression von TGF-ß und Il-8 wurde kaum beobachtet. Dies suggeriert, dass diese Wachstumsfaktoren das Wachstums des vaskulären Anteils vermitteln. Der Eker-Ratten-Stamm, ein natürlich vorkommendes Tiermodell mit erblichen Nierentumoren, trägt eine heterozygote Mutation des TSC2-Gens. Homozygote TSC2-negative Nachkommen dieser Ratten sterben bereits im Uterus. Von diesen Embryonen entnommene und kultivierte Zellen liefern TSC2-negative Fibroblasten (TSC2(- /- )REF), ein geeignetes Modell, um die angiogenetische Kapazität dieser Zellen im Vergleich zu normalen embryonalen Fibroblasten (TSC2(+/+)REF) zu erforschen. Kulturüberstände von TSC2(- /- )REF stimulierten das Wachstum der humanen mikrovaskulären Endothelzellen signifikant um 75-79% 10-23% mehr als Kulturüberstände der TSC2(+/+)REF. Initial für die Migration von Endothelzellen ist die Umorganisation des Zytoskeletts. Eine Bildung von Aktinstressfasern von Endothelzellen wurde durch Medium der TSC2(- /- )REF nach 2h hervorgerufen. Die stimulierten Endothelzellen streckten sich in die Länge, während die anderen, die mit Medium der TSC2(+/+)REF inkubiert wurden, polygonal blieben.

Um nach den relevanten Wachstumsfaktoren zu analysieren, wurden mit mehreren Antikörpern gegen Wachstumsfaktoren, wie anti- Angiogenin, -bFGF und -VEGF Neutralisationsversuche durchgeführt. Die Stimulation der Proliferation der Endothelzellen durch die TSC2(- /- )REF war um 56% 21% reduziert, wenn Anti-VEGF-Antikörper zu dem Zellkulturmedium hinzu gegeben wurden. Anti-Angiogenin und Anti-bFGF hatten keinen Effekt. Die zelluläre Expression der VEGF-mRNA wurde in einer semiquantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion bestimmt. VEGF-mRNA war in den TSC2(- /- )REF doppelt so viel vorhanden wie in den TSC2(+/+)REF. Der lösliche Anteil an sezerniertem VEGF im Kulturüberstand der REF wurde mittels metabolischer Markierung mit radioaktivem 35[ S] -Methionin und Immunpräzipitation durch Anti-VEGF-Antikörper bestimmt. Die Menge an gefälltem VEGF im Medium der TSC2(- /- )REF war deutlich größer als die Menge im Medium der TSC2(+/+)REF.

Um den Verlust von Tuberin der TSC2(- /- )REF zu der angiogenetischen Eigenschaft dieser Zellen zu zuordnen, mußte das fehlende Gen rekonstituiert werden. Nach der Einführung der TSC2-cDNA in den TSC2(- /- )REF mittels des Vektors pcDNA3/TSC2 und des retroviralen Vektors pLXIN/TSC2 wurde getestet, ob das wieder vorhandene Gen die Angiogenese hemmen konnte. Sobald die Zellen wieder Tuberin exprimierten, wurde die Proliferation der Endothelzellen gemessen, die zuvor mit Überständen der TSC2-reexprimierende TSC2(- /- )REF stimuliert wurden. Die Proliferation der Endothelzellen reduzierte sich bei der Stimulation mit Kulturüberständen von TSC2(- /- )REF, die mit TSC2 transfiziert waren, abhängig vom Transfektionsvektor: pcDNA3/TSC2-Massenkulturen um 30% 16%, pLXIN/TSC2-Massenkulturen um 50-55% 8-22% und pLXIN/TSC2-Klonen um 12-16% 10% reduziert. Die Aktinstressfaserbildung der Endothelzellen blieb nach Stimulation mit Medium von TSC2-reexprimierenden TSC2(- /- )REF aus. Die Sezernierung des VEGF in das Medium reduzierte sich ebenfalls bei den TSC2(- /- )REF, die TSC2 reexprimierten. Dies deutet darauf hin, dass Tuberin bei der Inhibition der Angiogenese eine Rolle spielt und dass ein funktioneller Verlust von Tuberin/TSC2 zur Angiogenese beiträgt.

Keywords:
  • Angiogenese
  • Vaskuläre Biologie
  • VEGF
  • Tuberous sclerosis
  • Eker Ratten

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