Synthese und spektroskopische Charakterisierung von Substratanaloga der H⁺-ATPase und Untersuchung der Ladungsrekombination in Reaktionszentren von Rhodobacter sphaeroides

Michael Rusch

ISBN 978-3-89722-696-8
170 Seiten, Erscheinungsjahr: 2001
Preis: 45.50 €

Die Primärprozesse der Photosynthese werden durch Proteine katalysiert, die in die Membranen der verschiedenen Photosynthese betreibenden Organismen (Pflanzen, Bakterien) eingelagert sind. Die Struktur des photosynthetischen Reaktionszentrums aus Rhodobacter sphaeroides ist mit einer Auflösung von 2,2 Å bekannt und die photochemische Reaktion läuft wie folgt ab. Nach Anregung eines Bakteriochlorophylldimers D wird ein Elektron aus dem angeregten Zustand über verschiedene Elektronenakzeptoren zu einem Ubichinon in der Bindungstasche Q_A und anschließend zu einem weiteren Ubichinon in der Bindungstasche Q_B übertragen.

In dieser Arbeit wurde die Kinetik der Ladungsrekombination vom primären Elektronenakzeptor Q_A^- und dem sekund"aren Elektronenakzeptor Q_B^- zum primären Elektronendonator D⁺ untersucht. Die Geschwindigkeitskonstanten dieser Rückreaktion k_AD und k_BD wurden gemessen und die Daten im Rahmen der Marcus- und der Jortner-Theorie des Elektronentransfers interpretiert. Die Freie Standardreaktionsenthalpie beider Reaktionen wurde über einen größeren Bereich variiert, indem Proteinmutanten verwendet wurden.

Durch gezielte Mutagenese wurden (i) Aminosäuren eingeführt, die Wasserstoffbrückenbindungen zu D ausbilden, und bei denen (ii) ein negativ geladener Rest (Aspartat) in Nachbarschaft zu Q_B entfernt wurde (DN(L213)). Diese DN(L213)-Mutation bewirkt eine Vergrößerung der Energiedifferenz zwischen den ladungsgetrennten Zuständen D⁺Q_A^-Q_B und D⁺Q_AQ_B⁺ um 120 meV, so dass die Ladungsrekombination aus dem Zustand D⁺Q_AQ_B^- über den direkten Weg verläuft, während über die Zahl der Wasserstoffbrückenbindungen die Standardreaktionsenthalpien um 350 meV variiert werden können.

Die Reaktionszentren der Mutanten wurden isoliert und gereinigt und die Geschwindigkeitskonstanten der direkten Ladungsrekombination von D⁺Q_B^- nach DQ_B im Temperaturintervall von 310 bis 240 K und bei Standardreaktionsenthalpien von -0,25 bis -0,60 eV untersucht. Die Reorganisationsenergie für diesen Prozeß beträgt 1,4 eV. Analoge Messungen für die direkte Ladungsrekombination von D⁺Q_A^- nach DQ_A ergaben im Bereich von 293 bis 77 K eine Abnahme der Reorganisationsenergie von 0,94 auf 0,73 eV, während für beide Prozesse das gleiche elektronische Kopplungsmatrixelement von 4,0·10^-8 eV gefunden wurde. Daraus folgt, daß der Unterschied der Geschwindigkeitskonstanten k_AD und k_BD trotz gleichem Donator-Akzeptor-Abstand und ähnlicher Freier Standardreaktionsenthalpie auf die unterschiedlichen Reorganisationsenergien zurückzuführen ist.

Ein weiteres Enzym, das in photosynthetische Membranen eingelagert ist, ist die H⁺-ATPase. Dieses Enzym koppelt einen transmembranen Protonentransport mit der Synthese bzw. Hydrolyse von ATP. Die Kinetik der Bindung der verschiedenen Substrate (ATP, ADP, Phosphat und Protonen) kann mit Hilfe schneller Mischtechniken untersucht werden. Um die Zeitauflösung bei solchen Messungen zu verbessern, wurden maskierte Substrate und ein fluoreszierendes Substrat synthetisiert. Die maskierten Substrate enthalten eine UV-abspaltbare Schutzgruppe, die die katalytische Reaktion verhindert. Bestrahlung mit einem UV-Laserblitz führt zur Freisetzung des Substrats und zum Start der Reaktion. Die maskierten Substrate wurden spektroskopisch charakterisiert und der Anteil der freigesetzten Substrate in Abhängigkeit von der Zahl der Laserblitze bestimmt. Beim maskierten ATP werden in einem Blitz ca. 15 \% freigesetzt, so daß Konzentrationssprünge von 100 μM ATP erreicht werden. Bei maskierten Protonen (4-Formyl-6-methoxy-3-nitrophenoxyessigsäure) werden ca. 30 \% H⁺ (100 μM) pro Blitz freigesetzt, von denen jedoch ein großer Anteil gepuffert wird. Die pH-Änderungen wurden mit den pH-Indikatoren Pyranin und Phenolrot untersucht. In schwach gepufferten Lösungen werden pH-Sprünge von etwa einer pH-Einheit erreicht, im Inneren von Liposomen werden pH-Änderungen von 0,3 Einheiten beobachtet. Soll die katalytische Reaktion (ATP-Synthese) mit Hilfe eines UV-Laserblitzes gestartet werden, so sind maskierte Protonen ungeeignet, maskiertes ADP und ATP sind wegen ihrer großen Bindungskonstante an das Enzym sehr gut geeignet. Maskiertes Phosphat ist etwas weniger geeignet, da für die Bindung von Phosphat an das Enzym höhere Konzentrationen erforderlich sind als photolytisch in einem Blitz freigesetzt werden können.