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Statische und zeitaufgelöste Fourier-Transform Infrarot-Untersuchungen des lichtinduzierten Photozyklus von Halorhodopsin aus Natronobacterium pharaonis

Christian Hackmann

ISBN 978-3-89722-367-7
164 Seiten, Erscheinungsjahr: 2000
Preis: 40.50 €
Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung des Photozyklus von pharaonis Halorhodopsin (pHR) mittels der statischen und zeitaufgelösten FTIR-Spektroskopie zum Inhalt.

Die physiologische Funktion von pHR ist der aktive lichtgetriebene Transport von Chloridionen vom äußeren Medium durch die Membran in das Zellinnere der Bakterie, um eine isoosmolare Zellteilung zu ermöglichen. Dabei wird ein zyklischer Transportmechanismus vermutet, der mehrere diskrete Intermediate beinhaltet, die sich in der Geometrie des Chromophors sowie des Proteingerüstes und in der Besetzung von Bindungsstellen mit Chloridionen unterscheiden.

Die Ionenselektivität von pHR erlaubt es, den Transport verschiedener Halogenide und auch Nitrat zu beobachten. Ein Wechsel der Anionen sollte sich in FTIR-Spektren an Verschiebungen von Banden zeigen, die entsprechende Bindungsstellen repräsentieren. Sie beinhalten allgemein die Wechselwirkungen dieser Gruppen mit der Umgebung. Eine genaue Untersuchung zeigt jedoch, daß im Rahmen der Meßgenauigkeit keine solchen Verschiebungen auftreten. Die Wechselwirkungen des transportierten Anions mit möglichen Bindungsstellen (Arg108, protonierte Schiffsche Base, Arg200) sind nur sehr schwach ausgeprägt. Der Transport kann deshalb nicht als Abfolge von direkter Bindung und nachfolgender Abgabe des Anions an positive Gruppen gesehen werden.

Mit Hilfe der zeitaufgelösten FTIR-Spektroskopie und einer folgenden mathematischen Analyse der Daten kann der Photozyklus von pHR in einem Zeitbereich von Nanosekunden bis Millisekunden aufgezeigt werden. Dabei ist die Charakterisierung von vier Intermediaten sowie ihrer Kinetiken möglich. Es kann jedoch keine Zuordnung der Chloridabgabe und -aufnahme zu einzelnen Schritten aufgrund ihrer Konzentrationsabhängigkeit erfolgen.

Nach der lichtinduzierten 13-cis Isomerisierung des Retinalchromophors entsteht um 0,1 Mikrosekunden pHR-K. Sein Absorptionsmaximum liegt vermutlich nahe dem des Grundzustands. Die 13-cis Isomerisierung bewirkt eine Verdrillung des Chromophors. pHR-K relaxiert zu pHR-L, das bei etwa 10 Microsekunden vorliegt. Bei diesem Intermediat wird eine Annäherung des Anions an die protonierte Schiffsche Base vermutet. Die Chromophorgeometrie ist 13-cis. Das folgende Intermediat liegt bei ca. 300 Mikrosekunden in größter Konzentration vor und wird als pHR-N bezeichnet. Es unterscheidet sich von pHR-L in der Proteingeometrie, der Chromophor ändert sich nicht. Der Zerfall in den Grundzustand erfolgt über ein weiteres Intermediat pHR-O. Dies kann aufgrund der kinetischen Parameter erst bei sehr kleinen Chloridkonzentrationen akkumuliert und somit untersucht werden. Es handelt sich bei pHR-O um ein rotverschobenes Intermediat, das im Millisekunden-Bereich entsteht. Bei ihm ist eindeutig die Reisomerisierung des Retinalproteins zurück nach all-trans erfolgt. Es schließt sich die Rückbildung des Grundzustands pHR an.

Keywords:
  • Holarhodopsin
  • Photozyklus
  • Infrarot-Spektroskopie

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